Ekstraksi DNA Genom Mikroba

Nov 24, 2021 | Library

DNA merupakan asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan organisme. DNA terdapat di nukleus, mitokondria, dan kloroplas. Tujuan dari isolasi DNA yaitu untuk memisahkan DNA dari bahan seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA yaitu penghancuran (lisis), ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Ekstraksi asam nukleat pada tumbuhan, hewan, dan mikroba merupakan tahapan yang fundamental untuk mengkarakterisasi genom dan
teknik pemetaan sebagai penanda molekuler dan untuk identifikasi dan isolasi gen untuk teknik genetika (genetic engineering) (Labra, et al., 2001). PCR (polymerase chain reaction) adalah teknologi yang umumnya digunakan dalam biologi molekuler untuk mendapatkan salinan DNA dalam jumlah besar yaitu ribuan bahkan jutaan salinan urutan DNA tertentu (Nasir, 2002). Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama yaitu DNA template, oligonukleotida primer, deoksiribonukleotida (dNTP), enzim DNA polimerase, dan komponen pendukung lainnya seperti senyawa buffer (Campbell, et al., 2000). PCR dapat digunakan untuk amplifikasi gen. Selain untuk amplifikasi DNA sebagai in vitro, juga digunakan untuk menentukan kondisi dari urutan nukleotida dari satu DNA yang mengalami mutasi (Yuwono dan Tribowo, 2006). Proses amplifikasi DNA dengan PCR dapat dicapai bila menggunakan primer oligonukleotida yang disebut amplimers (Habibah, 2009). Tujuan dari isolasi DNA adalah mendapatkan DNA murni dari dalam sel yang akan digunakan untuk menganalisis genotipe suatu organisme (Triwibowo, 2008). Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar sedangkan substansi ringan di atas dengan kata lain memisahkan pellet dan supernatan (Heldt, 2005). Pemecahan sel (lisis) bertujuan untuk mengeluarkan isi sel dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair (Doyle dan Doyle, 1990; Kheyrodin, et al., 2012).

Berikut ini salah satu prosedur kerja dalam mengisolasi DNA dari bakteri, kali ini topik kita mengenai mengisolasi genom bakteri Escherichia coli:

  1. Koloni bakteri Escherichia coli ditumbuhkan pada medium LB cair (Canamycin) 5 mL
    selama 16 – 18 jam
  2. Kultur Escherichia coli sebanyak 1 mL dimasukkan ke dalam microtube 1,5 mL
  3. Kultur disentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm selama 1 menit
  4. Supernatan dibuang
  5. Tahap 2-4 diulangi sampai semua kultur cair habis.
  6. Pellet diresuspensi dengan 750 μL buffer lisis lalu vortex (Buffer lisis: 25 mM EDTA, 50
    mM Tris-Cl, dan 0,5% SDS).
  7. Ditambahkan 750 μL kloroform-isoamil alkohol (24:1).
  8. Dinkubasi sampel selama 10 menit pada suhu – 80oC
  9. Sampel disentrifuga selama 3 menit pada kecepatan 14000 rpm.
  10. Supernatan diambil dengan menggunakan pipet ke dalam microtube 1,5 mL baru.
  11. Ditambahkan 750 mL kloroform-isoamil alcohol, disentrifugasi 14000 rpm, 3 menit.
  12. Supernatan dipindahkan ke dalam microtube 1,5 mL baru.
  13. Tahap 11 diulangi hingga diperoleh larutan jernih.
  14. Ditambahkan 1/10 volume LiCl dan 2,5 volume etanol absolut.
  15. Campuran diinkubasi pada -20oC selama 30 menit.
  16. Campuran disentrifuga 14000 rpm selama 3 menit.
  17. Supernatan dibuang kemudian ditambahkan etanol 70% sebanyak 200 μL.
  18. Disentrifuga 14000 rpm 3 menit.
  19. Supernatan dibuang kemudian dikering – anginkan pada suhu ruang selama 30 menit.
  20. Ditambahkan 50 μL buffer TE-RNAse pH 8.0, lalu microtube di-flick hingga pellet larut selanjutnya disimpan di – 20oC.
  21. Diperoleh isolat genom bakteri Escherichia coli (Suhandono, 2017)

Penggunaan SDS (Sodium dodecyl sulphate) berfungsi sebagai pelisis membran sel yang dapat berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA (Kurnia, 2011). Selain menggunakan SDS, detergen lain seperti cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) sering digunakan dalam melisiskan membran sel pada isolasi DNA tumbuhan (Suryo, 2004; Rossell, 1994). Dalam menggunakan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen–reagen lain seperti NaCl, EDTA, Tris – HCl, dan 2–mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan polisakarida, sedangkan 2–mercaptoethanol berfungsi untuk menghilangkan
polifenol dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan – ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang kemudian akan terpisah dengan DNA (Tribowo, 2008; Jamilah, 2005). EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) berperan sebagai pengaktifasi enzim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse. Selain itu, EDTA juga berfungsi untuk membantu destabilisasi membran dalam proses pelisisan (Rossel, 1994). Pada tahap 2 – 4 pada isolasi DNA bakteri Escherichia coli, dilakukan pengulangan sampai semua kultur cair habis. Hal ini dilakukan supaya mendapatkan konsentrasi dalam jumlah banyak. Kloroform – isoamil alkohol digunakan untuk mendenaturasi protein dan berfungsi
untuk mengikat senyawa organik lain selain DNA. Sedangkan LiCl berfungsi sebagai presipitat DNA. Etanol absolut digunakan untuk membersihkan residu setelah ditambahkan LiCl (Suryo, 2004). Kegiatan mengering – anginkan pellet pada suhu ruang bertujuan untuk menghilangkan etanol.

Daftar Pustaka
Annonym. 2012. Prinsip, Metode, dan Teknik Isolasi DNA. Online. Website: www.generasi-biologi.com/2012/08/isolasi-dna.html. Diakses pada: 21 September 2017 pukul 10.36 WIB.
Campbell, N.A., Jane, B.R., Lawrence, G.M. 2000. Biologi Jilid 1 Edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.
Corkill, G. Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic acids; Basic Tols & Techniques in
Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walkel, J.M., Rapley, R. USA: Humana Press.
Dolphin,W.D. 2008. Biological Investigation. New York: The Mc Graw-Hill Companies, Inc.
Doyle, J. J. dan Doyle, J.L. 1990. Isolation of Plant DNA From Fresh Tissue. Focus Moscow. 12(1): 13 – 15.
Habibah, N. 2009. Mengenal Beberapa Tipe Teknik PCR. Yogyakarta: Kanisius.
Heldt, H. W. 2005. Plant Biochemistry 3rd Edition. California: Academic Press.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comumus (L) Mrr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Malang: Universitas Negeri Malang.
Kheyrodin, H. dan Ghozvinian, K. 2012. DNA Purification and Isolation of Genomic DNA From Bacterial Species by Plasmid Purification System. African Journal of Agricultural Research. 7 (3): 121 – 142.
Kurnia, A. 2011. Dasar Teknologi Rekombinan. Jakarta: Universitas Indonesia.
Labra, M., Carreno-sanchez, E., Bardini, M., Basso, B., Sala, F., dan Scienza, A. 2001. Extration and Purification of DNA frm Grapevine Leaves. Vitis – Research note. 40(2): 101 – 102. Diakses pada 25 oktober 2017 pukul 13.07 WIB.
Nasir, M. 2002. Bioteknologi Potensi dan Keberhasilannya Dalam Bidang Pertanian. Jakarta: PT. Raja Grafindo Pustaka.
Rossell, P.J. 1994. Foundamental of Genetics. New York: Harper Collins College Pubishers.
Suhandono, S. 2017. Modul Praktikum Rekayasa Genetika. Institut Teknologi Bandung: Tidak diterbitkan.
Suryo. 2004. Genetika Strata 1. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada.
Triwibowo. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.
Yuwono dan Tribowo. 2006. Teori dan Amplikasi Polymerase Chain Reaction, Panduan Eksperimen PCR untuk Memecahkan Masalah Biologi Terkini. Yogyakarta: Penerbit Anding.